PCR reactie

Voor al je opdrachten van school, werk of al het andere waar je niet uit kan komen, ook voor je lastige vraagstelling waar je niet uit kan komen.Zowel chemie als andere onderwerpen mogen hier behandeld worden.
Post Reply
saskiia-90
Elektron
Posts: 8
Joined: 18 Dec 2011, 15:20

PCR reactie

Post by saskiia-90 » 21 Dec 2011, 13:24

Ik moet zelf een PCR reactie maken. Naar mijn idee heeft een PCR toch 3 stappen? Maar dit moet ik invullen;

Maak het PCR programma
Houd je aan de volgende voorwaarden als je het PCR programma maakt.
1. Denatureer het cDNA minstens 10 minuten, de Taq DNA polymerase is beschermd en moet worden geactiveerd bij een temperatuur van 95oC of hoger.
2. Omdat de reactie in de diagnostiek moet worden gebruikt moet hij binnen 90 minuten klaar zijn.
3. De snelheid van Taq DNA polymerase is ongeveer 1500 bp/minuut.
4. 40 cycli.
5. Op welk moment in de cyclus wordt de fluorescentie gedetecteerd?
6. Bepaal de anneallingtemperatuur mbv. de Tm van de primers.

1. .... min ... oC
2. ....sec ... oC
3. ....sec .....oC
4. ....sec 72 oC

Alles 40 ×

Fluorescentie detectie na / stap 1 / stap 2 / stap 3 / stap 4 /

Wie kan mij helpen??

User avatar
Reap
Argon
Posts: 681
Joined: 15 Sep 2011, 16:03
Chemistry interests: Inorganic
Location: Regio Eindhoven

Re: PCR reactie

Post by Reap » 21 Dec 2011, 16:40

1x 1: 10 min 95C (voor denaturatie).
40x 2: 1: naar annealing temp (anders voor elke primerset). 20 sec
2: naar ongeveer 70/75C voor Taq-polymerase elongatie. 20 sec
3: naar 95C (voor denaturatie) 20 sec
1x 3: naar 20C (uit) oneindig sec.

Dit programma gebruik ik grofweg als template en pas de temperaturen en tijden aan naar de opdracht.
(bijvoorbeeld lang target DNA langere annealingtijd en elongatie)
(de waardes die je nodig hebt kan je zelf wel berekenen met de data die je hebt denk ik)

Fluorescentie wordt bij ons apparaat niet bij een bepaalde stap gemeten. Maar als ik moet kiezen zou ik zeggen na elke elongatie stap.

En dus ja, PCR en het programma hebben 3 stappen:
1 denaturation
2 annealing
3 elongation

1 denaturatie
2 cyclus
3 eindtemp

saskiia-90
Elektron
Posts: 8
Joined: 18 Dec 2011, 15:20

Re: PCR reactie

Post by saskiia-90 » 22 Dec 2011, 11:33

klopt dit dan?

1. 10 min 95 oC (1×)
2. 20 sec 55 oC (40×)
3. 20 sec 72 oC (40×)
4. 20 sec 95 oC (40×)

User avatar
Reap
Argon
Posts: 681
Joined: 15 Sep 2011, 16:03
Chemistry interests: Inorganic
Location: Regio Eindhoven

Re: PCR reactie

Post by Reap » 22 Dec 2011, 17:57

Volgens dat schema zeg je dat stap 2 40x uitgevoerd wordt, dan stap 3 40x etc.

saskiia-90
Elektron
Posts: 8
Joined: 18 Dec 2011, 15:20

Re: PCR reactie

Post by saskiia-90 » 22 Dec 2011, 20:18

In mijn word documentje staat zo'n teken dat stap 2, 3 en 4 allemaal samen 40 × gaan.

Molbi
Elektron
Posts: 6
Joined: 03 Jan 2012, 00:20
Chemistry interests: Medical/Biological

Re: PCR reactie

Post by Molbi » 03 Jan 2012, 00:59

Hallo Saskiia-90,

Je 'voorwaarden' zijn niet helemaal correct. Hier wat tips en opmerkingen:
@1) DNA (en helemaal het korte cDNA) hoef je maar 10-20 seconden te denatureren. Als je een polymerase gebruikt dat inactief is bij kamertemperatuur, moet je het eerst activeren. Dit gaat meestal met een stap van 15 min bij 95° C.
@2) Diagnostiek is leuk, maar een volwaardig PCR programma doet er vaak 120 minuten over
@3) Ik heb de stelregel 1 kb per minuut geleerd
@4) akkoord, alhoewel je juist voor diagnostiek misschien 45 cycli wil.
@5) fluorescentie krijg je dmv toevoegen van o.a. SYBRGreen (licht op als het tussen dubbelstrengs DNA zit) of met een Taqman probe. In beide gevallen kun je dit dus alleen meten als al je DNA dubbelstrengs is. Dit is het geval aan het eind van iedere elongatiestap.
@6) Hier valt veel aan te rekenen, maar een stelregel is dat je ~5° C onder je Tm gaat zitten voor je annealing temperatuur.

Ik zou dus gaan voor
1x activatie 15' 95° C
40 x denaturatie 15" 95° C; annealing 20" bij je annealing-T; elongatie 60" 72° C [camera]
optionele stap: laatste elongatie 2' 72° C om er zeker van te zijn dat alles dubbelstrengs is.
vervolgens ga je oneindig naar 20°of 4°C, afhankelijk was je wilt doen met het eindproduct.

Op dit 'standaard' PCR protocol zijn vele variaties. Vaak doe je eerst een gradient-PCR om te kijken wat je optimale annealing temperatuur is.
Ook wordt er soms een temperatuur van ~60° C gebruikt voor zowel annealing als extensie.

Succes!

User avatar
Reap
Argon
Posts: 681
Joined: 15 Sep 2011, 16:03
Chemistry interests: Inorganic
Location: Regio Eindhoven

Re: PCR reactie

Post by Reap » 03 Jan 2012, 15:58

Dit klopt allemaal. Dit heeft onze begeleider uitgelegd bij een vorig project.
Jammergenoeg hebben we op school vaak tijdsdruk met practica. :|

Post Reply

Who is online

Users browsing this forum: Google [Bot] and 1 guest